STERILISASI EKSPLAN DAN INISIASI KRISAN, MATA TUNAS ANGGREK DAN SUBKULTUR ANGGREK
DASAR TEORI
Teknik kultur jaringan semakin berkembang dan popular sebagai salah satu alternatif dari propagasi tanaman vegetatif. Teknik ini meliputi metode propagasi aseksual dan tujuan utamanya adalah membuat tanaman lebih unggul. Kesuksesan dari beberapa seleksi in vitro dan manipulasi genetic pada tanaman tingkat tinggi tergantung pada kesuksesan dari regenerasi tanaman in vitro.
Keberhasilan pertama dalam kultur in vitro dicapai dalam praktek kultur organ. Menurut Shabde – Moses & Murhasige (1979), Hannig, pada tahun 1904 telah berhasil mendapatkan kecambah tanaman jenis crucifer dari embrio-embrio yang diisolasi dari biji yang belum matang (immature). Pertumbuhan organ yang tidak terbatas didalam kultur in vitro, pertama diperlihatkan oleh White dalam kultur akar tomat sekitar tahun 1934.
Kultur organ merupakan topik yang penting dalam penelitian antara tahun 1940-1960. Setelah itu penalitian dalam bidang ini berkurang, kecuali kultur pucuk/meristem. Kultur pucuk atau maristem mempunyai aspek praktis sebagai cara perbanyakan klon yang cepat dan bebas penyakit. Dewasa ini kultur maristem sudah merupakan tindakan komersial yang dikelola oleh perusahaan –perusahaan pembibitan.
Disamping kultur pucuk, pada tahun 60 an, kultur akar mendapat perhatian lagi pada beberapa tanaman tertentu sehubungan dengan tujuan produksi bahan sekunder, terutama untuk jenis-jenis persenyawaan yang berasosiasi dengan akar. Namun kultur akar yang pertumbuhannya tidak terbatas tersebut, dewasa ini pada umumnya dipusatkan pada hasil transformasi dengan Agrobacterium rhizogenes yang merupakan kultur auksin autotroph.
Secara keseluruhan kultur organ dalam ilmu fisiologi dipergunakan dalam studi diferensiasi dan fungsi dari jaringan-jaringan khusus. Kebutuhan nutrisi dan lingkungan, dapat dieksplorasi antara lebih tepat dalam kultur in vitro. Organ-organ tanaman yang sering digunakan sebagai eksplan tergangtung dari jening tanamannya, organ tersebut antara lain adalah:
1. Jaringan meristem, | |
2. Pucuk, | |
3. Pucuk kormus, | 10. Tuber caulogenum |
4. Buku kormus, | 11. Inflorescentia, |
5. Buku bulb | |
6. Buku batang tunggal, | 13. Hipokotil dan epikotil |
7. Ruas batang muda, | 14. Akar |
No | Nama Tanaman | Eksplan | Hasil |
1 | Multiplikasi pucuk | ||
2 | daun | Multiplikasi pucuk | |
3 | Gardenia sp. | Hypantium (dasar bunga) | Multiplikasi pucuk |
4 | Musa sp. | Inflorescentia Pucuk kormus | Multiplikasi pucuk |
5 | Amorphophallus sp. | pucuk | |
6 | Pucuk Buku bulbil | Multiplikasi pucuk | |
7 | Dioscorea microstachya | Buku batang | Multiplikasi pucuk |
8 | Manihot esculenta | Jaringan meristem | Tanaman bebas virus |
9 | Ipomoea batatas | Jaringan meriste |
Tabel 8. Spesies dan organ tanaman serta teknik kultur jaringan yang digunakan
Eksplan merupakan komponen yang harus ada dalam kultur jaringan. Karena menjadi komponen utama, maka karakteristik eksplan yang diambil harus baik, sehat dan muda sehingga mudah ditumbuhkan dalam media. Eksplan yang baik biasanya berasal dari pohon muda, dan diambil bagian jaringan meristemnya berupa pucuk, ketiak daun dan meristem akar. Eksplan yang umum digunakan adalah pucuk karena proses pertumbuhannya sudah terarah untuk membentuk tunas. Komposisi media untuk pertumbuhahan pucuk lebih mudah dibandingkan dengan bagian vegetatif lainnya.
Eksplan sangat penting dan menentukan keberhasilan. Eksplan yang baik adalah eksplan yang sehat dan muda. Eksplan yang muda diharapkan kandungan alkaloidnya masih rendah. Bila eksplan berasal dari alam usahakan tidak rusak atau mati, simpan pada tempat yang lembab misalnya disimpan dalam tisu yang dibasahi air. Eksplan harus dicuci dengan deterjen untuk menghilangkan fenol, alkaloid atau zat kimia lain yang terkandung dalam tanaman atau menghilangkan bulu-bulu pada tanaman keras (tanaman berkayu). Untuk memperoleh eksplan baik ambil eksplan dari trubusan atau buat trubusan bila belum ada.
Semakin besar eksplan peluang tumbuh semakin tinggi, tetapi sebaliknya semakin besar eksplan peluang kontaminan juga tinggi. Oleh karena itu ukuran eksplan yang optimal adalah 0,5 – 1.0 cm dan 0.05 – 0.1 mm untuk eksplan dari meristem.
Dalam rangkaian pelaksanaan kultur jaringan eksplan dan sterilisasi merupakan bagian yang sangat menentukan keberhasilan. Bahkan dapat dikatakan 90% keberhasilan kultur jaringan ditentukan keadaan eksplan dan proses sterilisasinya. Eksplan dari tanaman tua atau eksplan dari tanaman yang memiliki kandungan alkaloid tinggi akan menyebabkan pencoklatan pada media, hal ini akan menghambat pertumbuhan eksplan yang kita tanam. Untuk eksplan yang demikian perlu perlakuan awal yaitu perendaman dalam air mengalir selama 12-24 jam kemudian dicuci dengan rinso sampai benar-benar bersih.
.
Inisiasi Kultur
Inisiasi adalah pengambilan eksplan atau bahan tanam dari bagian tanaman indukan untuk kemudian dikulturkan. Bagian tanaman yang sering digunakan untuk kegiatan kultur jaringan adalah tunas, ujung akar, bunga, serbuk sari, batang.
Tujuan utama dari propagasi secara in-vitro tahap ini adalah pembuatan kultur dari eksplan yang bebas mikroorganisme serta inisiasi pertumbuhan baru (Wetherell, 1976). Ditambahkan pula menurut Yusnita, 2004, bahwa pada tahap ini mengusahakan kultur yang aseptik atau aksenik. Aseptik berarti bebas dari mikroorganisme, sedangkan aksenik berarti bebas dari mikroorganisme yang tidak diinginkan. Dalam tahap ini juga diharapkan bahwa eksplan yang dikulturkan akan menginisiasi pertumbuhan baru, sehingga akan memungkinkan dilakukannya pemilihan bagian tanaman yang tumbuhnya paling kuat,untuk perbanyakan (multiplikasi) pada kultur tahap selanjutnya (Wetherell, 1976).
Untuk mendapakan kultur yang bebas dari kontaminasi, eksplan harus disterilisasi. Sterilisasi merupakan upaya untuk menghilangkan kontaminan mikroorganisme yang menempel di permukaan eksplan. beberapa bahan kimia yang dapat digunakan untuk mensterilkan permukaan eksplan adalah NaOCl, CaOCl2, etanol, dan HgCl2.
Kesesuaian bagian tanaman untuk dijadikan eksplan, dipengaruhi oleh banyak faktor. Tanaman yang memiliki hubungan kekerabatan dekat pun, belum tentu menunjukkan respon in-vitro yang sama (Wetherell, 1976). Penggunaan eksplan yang tepat merupakan hal penting yang juga harus diperhatikan pada tahap ini. Umur fisiologis dan ontogenetik tanaman induk, serta ukuran eksplan bagian tanaman yang digunakan sebagai eksplan, merupakan faktor penting dalam tahap ini. Bagi kebanyakan tanaman, eksplan yang sering digunakan adalah tunas pucuk (tunas apikal) atau mata tunas lateral pada potongan batang berbuku. Namun belakangan ini, eksplan potongan daun yang dulunya hanya digunakan untuk tanaman-tanaman herba, seperti violces, begonia, petunia dan tomat, ternyata dapat digunakan juga untuk tanaman-tanaman berkayu seperti Ficus lyrata, Annona squamosa, dan melinjo. Eksplan yang dapat digunakan untuk memperbanyak tanaman Anthurium sendiri diantaranya adalah tunas pucuk, daun, tangkai daun muda, tangkai bunga, spate, spandik, biji, ruas batang dan anther.
Umur fisiologis dan umur ontogenetik jaringan tanaman yang dijadikan eksplan juga berpengaruh terhadap potensi morfogenetiknya. Umumnya, eksplan yang berasal dari tanaman juvenile mempunyai daya regenerasi tinggi untuk membentuk tunas lebih cepat dibandingakan dengan eksplan yang berasal dari tanaman yang sudah dewasa.
Masalah yang sering dihadapi pada kultur tahap ini adalah terjadinya pencokelatan atau penghitaman bagian eksplan (browning). Hal ini disebabkan oleh senyawa fenol yang timbul akibat stress mekanik yang timbul akibat pelukaan pada waktu proses isolasi eksplan dari tanaman induk. Senyawa fenol tersebut bersifat toksik, menghambat pertumbuhan atau bahkan dapat mematikan jaringan eksplan.
ALAT DAN BAHAN
Alat | Bahan |
Erlenmeyer | Anggrek (mata tunas) 3 ruas 2-3cm |
Nampan | Tunas Krisan (5 helai) |
Pinset panjang | Sabun cuci piring (sunlight) |
Pinset sedang | fungisida |
Pinset kecil | Anggrek (PBI c7) SK4 untuk subkultur |
Handle scaple | Mawar yang memiliki 2 cabang muda (5 helai) |
Botel selai | |
Alumunium foil |
PEMBAHASAN DAN CARA KERJA
Sterilisasi dan penanaman awal (inisiasi/induksi) dari bahan tanaman pada kondisi/ media aseptic
- Sterilisasi eksplan
Untuk proses sterilisasi eksplan bahan tanaman atau eksplan sebaiknya di mulai dari awal pemilihan eksplan karena jika eksplan bersih dari awal maka akan memudahkan proses sterilisasinya. Proses ini haruslah dilakukan dengan sangat hati-hati karena jika eksplan akan mati atau rusak. Bahan yang dapat digunakan untuk proses sterilisasi eksplan antara lain pencuci buah, Dhitane N.45, clorox, dan alkohol 96%. Catatan untuk penggunaan clorox haruslah hati-hati karena bahan ini dapat merusak eksplan. Ukuran yang baik dalam penggunaannya adalah 1% direndam 1 menit sampai dengan 20% direndam 20 menit. Secara umum proses sterilisasi eksplan (salah satu alternatif) yaitu urutannya sebagai berikut:
a. Bahan tanaman dimasukkan ke dalam cawan petri steril atau botol steril, tergantung dari ukuran eksplan yang di gunakan
b. Ke dalam botol steril dituangkan larutan clorox 20% sampai bahan tanaman terendam kemudian di biarkan selama 7 menit
c. Sementara itu, cawan petri lain disiapkan dan di isi dengan air steril
d. Setelah direndam selam 7 menit dalam clorox 20%, bahan tanaman di bilas dalam air steril di cawan petri kedua selama 5 menit
e. Bahan tanaman direndam lagi di dalam larutan betadine 0,25% selama 3-5 menit
f. Bahan tanaman dibilas dua kali dalam air steril dengan lama perendaman masing-masing 5 menit agar sisa-sisa betadine pada eksplan dapat larut
g. Bahan tanaman di tanam dalam media dengna menggunakan alat-alat yang sudah steril dan di lakukan di dalam laminar air flow cabinet
Saat praktikum, jenis eksplan yang disterilkan adalah anggrek, dan krisan. Berikut tahapan masing-masing eksplan:
2. Sterilisasi eksplan anggrek
Anggrek yang terkena jamur harus disterilkan lebih intensif karena ditakutkan jamur terbawa ketika proses penanaman dilakukan. Untuk mengurangi hal tersebut maka ekslapn di cuci dengan sunlight menggunkan spondan direndam menggunakan anti bakteri yaitu clorox, alkohol maupun dhitane N45 atau fungisida. Setelah itu di bilas hingga bersih menggunakan aquades steril. Untuk anggrek yang tidak terkena jamur maka cukup di lakukan pencucian denagan menggunakan sunlight lalu di bilas dengan air bersih.
3. Sterilisasi eksplan krisan
Sama seperti sterilisasi anggrek, krisan juga di cuci dengan sunlight menggunkan spondan direndam menggunakan anti bakteri yaitu clorox, alkohol maupun dhitane N45. Setelah itu di bilas hingga bersih menggunakan air bersih. Untuk anggrek yang tidak terkena jamur maka cukup di lakukan pencucian denagan menggunakan sunlight lalu di bilas dengan air bersih. Akan tetapi secara perlahan-lahan karena daun krisan mudah rusak.
2. Penanaman / inisiasi
Proses penanaman secara umum tahapannya adalah sebagai berikut:
1. 10 menit sebelum proses inisisasi dilakukan maka dinyalakan lampu UV
2. Sterilakan laminar air flow cabinet dengan cara di semprotkan alkohol lalu di bersihkan dengan kapas atau tissue.
3. Alat-alat dan lampu alkohol di letakkan agak di sebelah kanan, lampu alkohol di usahakan tidak terlalu dekat dengan wadah alkohol
4. Sebelum mengambil bahan tanaman, pinset dicelupkan ke dalam alkohol 76% kemudian di bakar di atas api, setelah itu di dinginkan dengan cara meletakkannya di botol kosong steril
5. Media tumbuh di siapkan, tutupnya (alumunium foil) di buka dengan hati-hati supaya bagian dalam tutup tidak tersentuh.
6. Mulut botol di bakar di atas api, ketika membakar mulut botol, sebaiknya botol di putar dengan dengan titik tengah lingkarannya sebagai poros agar seluruh bagian mulut botol terkena api secara merata.
7. Dengan pinset steril yang sudah dingin, eksplan di ambil dan di masukkan ke dalam media
8. Sebelum di tutup, mulut botol sebaiknya di bakar dulu
9. Alumunium foil sebagai tutup di tempelkan di atas api lalu di tutupkan dan di kencangkan dengan menggunkan kling wrap
10. Kemudian dituliskan label: jenis tanaman, tanggal penanaman, tingkat kultur dan nama penanaman
11. Tanaman yang sudah menjadi botolan kemudian di letakkan di dalam inkubator setelah di rasa cukup misalkan selama 2-4 hari tanaman botolan di pindahkan ke ruang inkubasi
Selama praktikum berlangsung,proses penanaman dilakukan pada tanaman:
2.1. Penanaman anggrek dan krisan
Penanaman anggrek di laboratorium ini dilakukan pada media MS.eksplan dapat berupa biji yang telah matang ataupun mata tunas. Prosesnya dilakukan pada ruangan yang steril dn proses seluruhnya dilakukan pada lamilar air folw cabinet (LAF cab).tahapan penanamannya adalah sebagai berikut:
1. Nyalakan LAF cab serta lampunya kecuali lampu yang memancarkan cahaya UV minimal 10 menitbsebelum proses penanaman berlangsung.
2. Jika meja cabinet sudah siap, nyalakan bunsen burner
3. Sebelum mengambil bahan tanaman, alat-alat yang akan digunakan dicelupkan ke dalam alohol 76% kemudian di bakar sampai alkohol yang melekat pada alat terbakar habis. Setelah itu, didinginkan dengan cara meletakkannya pada botol kosong yangsudah steril
4. Celupkan eksplan ke dalam alkohol 96% kemudian di lewatkan di atas api dan di ulang sebanyak 3 kali pengulangan, usahakan agar eksplan tidak terlalu lama berada di dekat api agar eksplan tidak layu, biasanya jika eksplan terlalu lama di lewatkan di atas api ataupun eksplan terbakar, maka eksplan tersebut tidak dapat tumbuh
5. Jika eksplan berupa biji anggek maka biji anggrek tersebut dibuka dengan menggunakan pinset dan pisau steril kemudian embrio dikeluarkan dari bijinya tapi jika eksplan berupa mata tunas maka diambil mata tunas muda dengan satu kali sayatan tanpa terputus. Dan untuk krisan dibuang daun yang sudah tua atau jelek, dapat juga diambil dari daunnya dan ada tulang daunya sebagi ekspal.
6. Simpan embrio pada cawan petridish dan tutup
7. Media tumbuh disiapkan. Tutupnya (alumunium foil) dibuka dengan hati-hati agar bagian dalam tutup tidak tersentuh kemudian dibakar pada api baik bagian dalam tutup atupun bagian luar tutup
8. Botol dipegang dengan tangan kiri dalam keadaan miring. Mulut botol dibakar di atas api.
9. Ambil embrio dengan menggunakan sudip jika eksplan berupa biji anggrek dan ambil menggunakan pinset panjang jika eksplan berupa bakal tunas muda
10. Masukkan embrio kedalam media
11. Tutup mulut botol dengan menggunakan alumuniumfoil dan sebaiknya tutup tersebut di bakar dulu
12. Tutup botol dikencangkan dan diberi klingwrap
4. Subkultur anggrek
Subkultur ini dilakukan terhadsap eksplan yang telah tumbuh dan dipindahkan ke media yang baru dengan komposisi 25-30 tanaman per botol sehingga media yang bari akan memberikan ruang yang baik untuk tanaman sebagai pendorong perkembangan dan persediaan hara yang cukup atau tidak berkompetisi dalam unsur hara.
KESIMPULAN
Sterilisasi adalah menghilangkan atau mematikan semua bakteri dan jamur yang ada dipermukaan eksplan atau di dalam sel-sel eksplan. Oleh karena itu selain melakukan sterilisasi permukaan juga dilakukan sterilisasi sistemik karena kemungkinan banyak bakteri dan jamur tidak mati/tidak terjangkau dengan sterilisasi permukaan. Sterilisasi sistemik untuk mematikan bakteri dan jamur yang terdapat di dalam sel-sel eksplan.
Ukuran keberhasilan sterilisasi adalah bila kita berhasil menumbuhkan eksplan tanpa terserang bakteri dan jamur. Untuk mencapai keberhasilan ini banyak rangkaian kegiatan yang harus diperhatikan. Sterilisasi eksplan merupakan salah satu rangkaian kegiatan yang dimaksud, oleh karena itu keakuratan sterilisasi eksplan belum menjamin tanaman tumbuh tanpa kontaminan. Hal-hal lain yang perlu diperhatikan adalah sterilisasi alat, media, tempat menabur dan orang yang menabur. Semua rangkaian kegiatan penting ini harus dilakukan secara teliti dan yakin dalam keadaan steril. Bila dengan kondisi demikian belum juga mengasilkan tanaman yang tidak kontaminan maka harus dievaluasi kembali tahap-tahap mana yang dirasakan kurang sempurna.
Ukuran eksplan juga mempengaruhi keberhasilan kultur. Eksplan dengan ukuran kecil lebih mudah disterilisasi dan tidak membutuhkan ruang serta media yang banyak, namun kemampuannya untuk beregenerasi juga lebih kecil sehingga dibutuhkan media yang lebih kompleks untuk pertumbuhan dan regenerasinya. Sebaliknya semakin besar eksplan, maka semakin besar kemungkinannya untuk membawa penyakit dan makin sulit untuk disterilkan, membutuhkan ruang dan media kultur yang lebih banyak. Ukuran eskplan yang sesuai sangat tergantung dari jenis tanaman yang dikulturkan, teknik dan tujuan pengkulturannya
DAFTAR PUSTAKA
- http://Sepdianluri@yahoo.com
- http://elearning.unram.ac.id/KulJar/BAB%20I%20PENDAHULUAN/GAYA%20BELAJAR%20KULTUR%20JARINGA %20MELALUI%20PUBLIKASI%20WWW.h
- D.P.S. Hendaryono, A. Wijayani., Kultur Jaringan (Pengertian dan Petunjuk, 1994)
- kultur-jaringan.blogspot.com
- http://eshaflora.blogspot.com/2010/03/tanya-jawab-seputar-kultur-jaringan.html
Tidak ada komentar:
Posting Komentar