kultur jaringan III

STERILISASI EKSPLAN MATA TUNAS PISANG, BAWANG DAN BIJI ANGGREK

DASAR TEORI

Kultur organ merupakan topik yang penting dalam penelitian antara tahun 1940-1960. Setelah itu penalitian dalam bidang ini berkurang, kecuali kultur pucuk/meristem. Kultur pucuk atau maristem mempunyai aspek praktis sebagai cara perbanyakan klon yang cepat dan bebas penyakit. Dewasa ini kultur maristem sudah merupakan tindakan komersial yang dikelola oleh perusahaan –perusahaan pembibitan.

Disamping kultur pucuk, pada tahun 60 an, kultur akar mendapat perhatian lagi pada beberapa tanaman tertentu sehubungan dengan tujuan produksi bahan sekunder, terutama untuk jenis-jenis persenyawaan yang berasosiasi dengan akar. Namun kultur akar yang pertumbuhannya tidak terbatas tersebut, dewasa ini pada umumnya dipusatkan pada hasil transformasi dengan Agrobacterium rhizogenes yang merupakan kultur auksin autotroph.

Secara keseluruhan kultur organ dalam ilmu fisiologi dipergunakan dalam studi diferensiasi dan fungsi dari jaringan-jaringan khusus. Kebutuhan nutrisi dan lingkungan, dapat dieksplorasi antara lebih tepat dalam kultur in vitro. Organ-organ tanaman yang sering digunakan sebagai eksplan tergangtung dari jening tanamannya, organ tersebut antara lain adalah:

1. Jaringan meristem,	8. Helaian daun,
2. Pucuk,	9. Tuber rhizogenum
3. Pucuk kormus,	10. Tuber caulogenum
4. Buku kormus,	11. Inflorescentia,
5. Buku bulb	12. Mata Tunas samping
6. Buku batang tunggal,	13. Hipokotil dan epikotil
7. Ruas batang muda,	14. Akar

                                                                                                    

            Eksplan merupakan komponen yang harus ada dalam kultur jaringan. Karena menjadi komponen utama, maka karakteristik eksplan yang diambil harus baik, sehat dan muda sehingga mudah ditumbuhkan dalam media. Eksplan yang baik biasanya berasal dari pohon muda, dan diambil bagian jaringan meristemnya berupa pucuk, ketiak daun dan meristem akar. Eksplan yang umum digunakan adalah pucuk karena proses pertumbuhannya sudah terarah untuk membentuk tunas. Komposisi media untuk pertumbuhahan pucuk lebih mudah dibandingkan dengan bagian vegetatif lainnya.

            Eksplan sangat penting dan menentukan keberhasilan. Eksplan yang baik adalah eksplan yang sehat dan muda. Eksplan yang muda diharapkan kandungan alkaloidnya masih rendah. Bila eksplan berasal dari alam usahakan tidak rusak atau mati, simpan pada tempat yang lembab misalnya disimpan dalam tisu yang dibasahi air. Eksplan harus dicuci dengan deterjen untuk menghilangkan fenol, alkaloid atau zat kimia lain yang terkandung dalam tanaman atau menghilangkan bulu-bulu pada tanaman keras (tanaman berkayu). Untuk memperoleh eksplan baik ambil eksplan dari trubusan atau buat trubusan bila belum ada.

Semakin besar eksplan peluang tumbuh semakin tinggi, tetapi sebaliknya semakin besar eksplan peluang kontaminan juga tinggi. Oleh karena itu ukuran eksplan yang optimal adalah 0,5 – 1.0 cm dan 0.05 – 0.1 mm untuk eksplan dari meristem.

            Dalam rangkaian pelaksanaan kultur jaringan eksplan dan sterilisasi merupakan bagian yang sangat menentukan keberhasilan. Bahkan dapat dikatakan 90% keberhasilan kultur jaringan ditentukan keadaan eksplan dan proses sterilisasinya. Eksplan dari tanaman tua atau eksplan dari tanaman yang memiliki kandungan alkaloid tinggi akan menyebabkan pencoklatan pada media, hal ini akan menghambat pertumbuhan eksplan yang kita tanam. Untuk eksplan yang demikian perlu perlakuan awal yaitu perendaman dalam air mengalir selama 12-24 jam kemudian dicuci dengan rinso sampai benar-benar bersih.

Inisiasi Kultur

            Inisiasi adalah pengambilan eksplan atau bahan tanam dari bagian tanaman indukan untuk kemudian dikulturkan. Bagian tanaman yang sering digunakan untuk kegiatan kultur jaringan adalah tunas, ujung akar, bunga, serbuk sari, batang.

            Tujuan utama dari propagasi secara in-vitro tahap ini adalah pembuatan kultur dari eksplan yang bebas mikroorganisme serta inisiasi pertumbuhan baru (Wetherell, 1976). Ditambahkan pula menurut Yusnita, 2004, bahwa pada tahap ini mengusahakan kultur yang aseptik atau aksenik. Aseptik berarti bebas dari mikroorganisme, sedangkan aksenik berarti bebas dari mikroorganisme yang tidak diinginkan. Dalam tahap ini juga diharapkan bahwa eksplan yang dikulturkan akan menginisiasi pertumbuhan baru, sehingga akan memungkinkan dilakukannya pemilihan bagian tanaman yang tumbuhnya paling kuat,untuk perbanyakan (multiplikasi) pada kultur tahap selanjutnya (Wetherell, 1976).

            Untuk mendapakan kultur yang bebas dari kontaminasi, eksplan harus disterilisasi. Sterilisasi merupakan upaya untuk menghilangkan kontaminan mikroorganisme yang menempel di permukaan eksplan. beberapa bahan kimia yang dapat digunakan untuk mensterilkan permukaan eksplan adalah NaOCl, CaOCl2, etanol, dan HgCl2.

            Kesesuaian bagian tanaman untuk dijadikan eksplan, dipengaruhi oleh banyak faktor. Tanaman yang memiliki hubungan kekerabatan dekat pun, belum tentu menunjukkan respon in-vitro yang sama (Wetherell, 1976). Penggunaan eksplan yang tepat merupakan hal penting yang juga harus diperhatikan pada tahap ini. Umur fisiologis dan ontogenetik tanaman induk, serta ukuran eksplan bagian tanaman yang digunakan sebagai eksplan, merupakan faktor penting dalam tahap ini. Bagi kebanyakan tanaman, eksplan yang sering digunakan adalah tunas pucuk (tunas apikal) atau mata tunas lateral pada potongan batang berbuku. Namun belakangan ini, eksplan potongan daun yang dulunya hanya digunakan untuk tanaman-tanaman herba, seperti violces, begonia, petunia dan tomat, ternyata dapat digunakan juga untuk tanaman-tanaman berkayu seperti Ficus lyrata, Annona squamosa, dan melinjo. Eksplan yang dapat digunakan untuk memperbanyak tanaman Anthurium sendiri diantaranya adalah tunas pucuk, daun, tangkai daun muda, tangkai bunga, spate, spandik, biji, ruas batang dan anther.

ALAT DAN BAHAN

Alat	Bahan
Erlenmeyer	Pisang  (mata tunas) 3 ruas
Nampan	bawang (3-5 ruas)
Pinset panjang	Sabun cuci piring (sunlight)
Pinset sedang	fungisida
Pinset kecil	N45
Handle scaple	Biji Anggrek
Botol selai	Betadin
Alumunium foil	Aquades

PEMBAHASAN DAN CARA KERJA

Sterilisasi dan penanaman awal (inisiasi/induksi) dari bahan tanaman pada kondisi/ media aseptic

I.                    Sterilisasi eksplan

Untuk proses sterilisasi eksplan bahan tanaman atau eksplan sebaiknya di mulai dari awal pemilihan eksplan karena jika eksplan bersih dari awal maka akan memudahkan proses sterilisasinya. Proses ini haruslah dilakukan dengan sangat hati-hati karena jika eksplan akan mati atau rusak. Bahan yang dapat digunakan untuk proses sterilisasi eksplan antara lain pencuci buah, Dhitane N.45, clorox, dan alkohol 96%. Catatan untuk penggunaan clorox haruslah hati-hati karena bahan ini dapat merusak eksplan. Ukuran yang baik dalam penggunaannya adalah 1% direndam 1 menit sampai dengan 20% direndam 20 menit. Secara umum proses sterilisasi eksplan (salah satu alternatif) yaitu urutannya sebagai berikut:

a.       Bahan tanaman dimasukkan ke dalam cawan petri steril atau botol steril, tergantung dari ukuran eksplan yang di gunakan

b.      Ke dalam botol steril dituangkan larutan clorox 20% sampai bahan tanaman terendam kemudian di biarkan selama 7 menit

c.       Sementara itu, cawan petri lain disiapkan dan di isi dengan air steril

d.      Setelah direndam selam 7 menit dalam clorox 20%, bahan tanaman di bilas dalam air steril di cawan petri kedua selama 5 menit

e.       Bahan tanaman direndam lagi di dalam larutan betadine 0,25% selama 3-5 menit

f.       Bahan tanaman dibilas dua kali dalam air steril dengan lama perendaman masing-masing 5 menit agar sisa-sisa betadine pada eksplan dapat larut

g.      Bahan tanaman di tanam dalam media dengna menggunakan alat-alat yang sudah steril dan di lakukan di dalam laminar air flow cabinet

Saat praktikum, jenis eksplan yang disterilkan adalah anggrek, dan krisan. Berikut tahapan masing-masing eksplan:

1.       sterilisasi eksplan pisang

Pisang merupakan tanaman jenis tumbuhan yang mengeluarkan getah (fenol) terus menerus sehingga harus dibersihkan sebaik mungkin agar efek dari getahnya tidak mempersulit proses pertumbuhan tanaman tersebut. Tahapannya adalah:

a.       Di sterilkan / direndam menggunakan sunlight dan di biarkan selama 15 menit

b.      Di rendam menggunakan dithane N45 selama 15 menit yang bertujuan untuk menghilangkan jamur yang masih tersisa

c.       Kemudian di bilas dengan aquadest steril sampai bersih agar dhitane N45 tidak menempel

2.   penanaman pisang

1.       Nyalakan LAF cab serta lampunya kecuali lampu yang memancarkan cahaya UV minimal 10 menitbsebelum proses penanaman berlangsung.

2.      Jika meja cabinet sudah siap, nyalakan bunsen burner

3.      Sebelum mengambil bahan tanaman, alat-alat yang akan digunakan dicelupkan ke dalam alohol 76% kemudian di bakar sampai alkohol yang melekat pada alat terbakar habis. Setelah itu, didinginkan dengan cara meletakkannya pada botol kosong yangsudah steril

4.      Eksplan berupa mata tunas yang berasal dari bonggol pisang.

5.      Dengan pinset steril yang sudah dingin, eksplan dibuka sehingga di dapatkan titik tumbuh atau titik potensial dan dipotong membentuk segitiga atau lingkaran. Proses pemotongan dilakukan pda cawan petri steril dan apabil sedah selesai di celupkan pada aquades steril dan simpan dalam cawan petri yang telah dialasi kertas saring

6.      Media tumbuh disiapkan. Tutupnya (alumunium foil) dibuka dengan hati-hati agar bagian dalam tutup tidak tersentuh kemudian dibakar pada api baik bagian dalam tutup atupun bagian luar tutup

7.      Botol dipegang dengan tangan kiri dalam keadaan miring. Mulut botol dibakar di atas api.

8.      Ambil ekspaln dan masukkan kedalam media

9.      Tutup media dengan menggunakan alumunium foil dan dilapisi dengan mengguankan kling wrap

2.1.  Penanaman biji anggrek dan bawang

Penanaman anggrek di laboratorium ini dilakukan pada media MS.eksplan dapat berupa biji yang telah matang ataupun mata tunas. Prosesnya dilakukan pada ruangan yang steril dn proses seluruhnya dilakukan pada lamilar air folw cabinet (LAF cab).tahapan penanamannya adalah sebagai berikut:

1.      Nyalakan LAF cab serta lampunya kecuali lampu yang memancarkan cahaya UV minimal 10 menitbsebelum proses penanaman berlangsung.

2.      Jika meja cabinet sudah siap, nyalakan bunsen burner

3.      Sebelum mengambil bahan tanaman, alat-alat yang akan digunakan dicelupkan ke dalam alohol 76% kemudian di bakar sampai alkohol yang melekat pada alat terbakar habis. Setelah itu, didinginkan dengan cara meletakkannya pada botol kosong yang sudah steril

4.      Celupkan eksplan ke dalam alkohol 96% kemudian di lewatkan di atas api dan di ulang sebanyak 3 kali pengulangan, usahakan agar eksplan tidak terlalu lama berada di dekat api agar eksplan tidak layu, biasanya jika eksplan terlalu lama di lewatkan di atas api ataupun eksplan terbakar, maka eksplan tersebut tidak dapat tumbuh

5.      Jika eksplan berupa biji anggek maka biji anggrek tersebut dibuka dengan menggunakan pinset dan pisau steril kemudian embrio dikeluarkan dari bijinya tapi jika eksplan berupa mata tunas maka diambil mata tunas muda dengan satu kali sayatan tanpa terputus. Dan untuk bawang dibuang bagian dagingnya yang menempel, sampai menemukan tunas muda yang ada ditengah-tengan daging bawang.

6.      Simpan embrio atau tunas  pada cawan petridish dan tutup

7.      Media tumbuh disiapkan. Tutupnya (alumunium foil) dibuka dengan hati-hati agar bagian dalam tutup tidak tersentuh kemudian dibakar pada api baik bagian dalam tutup atupun bagian luar tutup

8.      Botol dipegang dengan tangan kiri dalam keadaan miring. Mulut botol dibakar di atas api.

9.      Ambil embrio dengan menggunakan sudip jika eksplan berupa biji anggrek dan ambil menggunakan pinset panjang jika eksplan berupa bakal tunas muda

10.  Masukkan embrio kedalam media

11.  Tutup mulut botol dengan menggunakan alumuniumfoil dan sebaiknya tutup tersebut di bakar dulu

12.  Tutup botol dikencangkan dan diberi klingwrap

KESIMPULAN

Subkultur harus dilakukan dengan cara yang steril dan benar sehingga dalam proses pertumbuhan ekspaln akan baik dan mencapai apa yang diharapkan. Akan tetapi perlu memperhatikan hal-hal yang mesti diperhatikan

karena itu selain melakukan sterilisasi permukaan juga dilakukan sterilisasi sistemik karena kemungkinan banyak bakteri dan jamur tidak mati/tidak terjangkau dengan sterilisasi permukaan. Sterilisasi sistemik untuk mematikan bakteri dan jamur yang terdapat di dalam sel-sel eksplan. Bila kita berhasil menumbuhkan eksplan tanpa terserang bakteri dan jamur.

Sterilisasi eksplan merupakan salah satu rangkaian kegiatan, oleh karena itu keakuratan sterilisasi eksplan belum menjamin tanaman tumbuh tanpa kontaminan. Hal-hal lain yang perlu diperhatikan adalah sterilisasi alat, media, tempat menabur dan orang yang menabur. Semua rangkaian kegiatan penting ini harus dilakukan secara teliti dan yakin dalam keadaan steril. Bila dengan kondisi demikian belum juga mengasilkan tanaman yang tidak kontaminan maka harus dievaluasi kembali tahap-tahap mana yang dirasakan kurang sempurna.

Jika pada inisiasi terdapat konta minasi berarti ada kesalahn dalam proses subkultur atau juga proses sterilisasi yang kurang tertib, sehingga menyebabkan tanaman yang akan dikultur terkontaminasi oleh jamur atau penyakit lainnya.

DAFTAR PUSTAKA 

1.  http://Sepdianluri@yahoo.com   
2. http://elearning.unram.ac.id/KulJar/BAB%20I%20PENDAHULUAN/GAYA%20BELAJAR%20KULTUR%20JARINGA %20MELALUI%20PUBLIKASI%20WWW.h
3.  D.P.S. Hendaryono, A. Wijayani., Kultur Jaringan (Pengertian dan Petunjuk, 1994)
4.   kultur-jaringan.blogspot.com
5. http://eshaflora.blogspot.com/2010/03/tanya-jawab-seputar-kultur-jaringan.html