STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIA TANAM
DASAR TEORI
Kultur jaringan tanaman adalah suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma, sekelompok sel, jaringan dan organ yang menumbuhkannya dalam kondisi aseptik, sehingga bagian tanaman tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi tumbuh menjadi tanaman lengkap kembali. Kultur jaringan pertama kali dilakukan oleh George Morel, seorang botanis prancis pada 1965. Ia melakukan percobaan untuk mendapatkan tanaman anggrek bebas virus. Tahun 1970, teknologi ini dikembangkan secara komersial di sejumlah negara maju. Teknik ini meluas di dunia pada 1980. Pada awalnya teknik ini digunakan pada tanaman hias dan bunga potong untuk di ekspor.
Di negara-negara maju seperti Amerika, Jepang, Eropa, teknik kultur jaringan sudah lama berkembang bukan hanya untuk perbanyakan tetapi juga untuk tujuan lain, di antaranya mendapatkan tanaman bebas penyakit terutama virus, memproduksi senyawa metabolik sekunder, perbaikan tanaman, pelestarian plasma nutfah berupa sel atau organ-organ tumbuhan yang dapat diregenerasikan menjadi tanaman lengkap. Di Indonesia, teknik kultur jaringan sudah digunakan untuk tujuan perbanyakan tanaman.
Pelaksanaan kultur jaringan tidak lepas dari proses sterilisasi. Proses kegiatan kultur jaringan secaara umum terdiri dari 5 tahap, yaitu : (Gina,2000)
Tahap I : persiapan alat, bahan dan media
Tahap II : sterilisasi dan penanaman awal (inisisasi/induksi) dari bahan tanaman pada kondisi media aseptik
Tahap III : perangsangan regenerasi tunas secara aktif sehingga tunas cepat berlipat ()
Multiplikasi
Tahap IV : perangsangan bagian dasar eksplan dan memacu pertumbuhan akar (perakaran)
Tahap V : Transplanting/pemindahan pot untuk adaptasi dari kondisi aseptic pada green house untuk pengembangan akar lebih sempurna sebelum penanaman di lapangan.
Banyak sekali keuntungan kultur jaringan, hal tersebut tidak terlepas dari tujuan kultur jaringan yaitu menghasilkan benih dalam jumlah banyak, bermutu, seragam dalam waktu singkat, sifat tanaman sama dengan induknya, kesehatan benih lebih terjamin, serta kecepatan tumbuh lebih cepat dibandingkan konvensional.
Sterilisasi adalah salah satu prosedur yang digunakan untuk menghilangkan mikroorganisme. Pemiliharaan suci hama dan penyakit (keaseptikan) atau kondisi steril sangat esensial untuk keberhasilan dalam prosedur kultur jaringan. Keadaan aseptis ini diperlukan untuk semua botol kultur yanga akan digunakan, media kultur, peralatan yang akan digunakan dalam kegiatan penanaman eksplan dan eksplan yang akan dikulturkan itu sendiri. Pemeliharaan kebersihan udara di dalam ruang kultur dan lantai kultur dari debu itu dua hal yang sangat penting dan harus tetap terjaga kebersihannya. Laminar Air Flow (LAF) harus tetap terjaga kebersihannya dan sebaiknya alat yang digunakan untuk kultur jaringan tanaman dan kultur mikrobiologi serta patogi terpisah. LAF yang digunakan oleh mikrobiologist dan patologist sebaiknya menggunakan LAF yang mempunyai arah blower dari atas ke bawah (aliran hembusan udara dari arah atas ke bawah) atau vertical airflow model sedangkan LAF yang digunakan untuk keperluan kultur jaringan mempunyai arah hembusan udara dari belakang ke depan atau horizontal airflow model
Salah satu faktor pembatas dalam keberhasilan kultur jaringan adalah kontaminasi yang dapat terjadi pada setiap saat dalam masa kultur. Kontaminasi dapat berasal dari :
1. Eksplan, baik eksternal maupun internal.
2. Organisme kecil yang masuk ke dalam media. Dengan keadaan di Indonesia, yang paling sering menyebabkan kontaminasi adalah semut.
3. Botol kultur atau alat-alat tanam yang kurang steril.
4. Lingkungan kerja dan ruang kultur yang kotor (spora di udara).
5. Kecerobohan dalam pelaksanaan.
Berdasarkan perbedaan benda yang akan disterilkan, umumnya prosedur sterilisasi dapat dikelompokan dalam tiga kategori, yakni:
Penanaman ekplan dan prosedur lain seperti isolasi protoplasma, sering kali dilakukan dalam kotak pindah steril atau dikenal dengan Laminar Air Flow cabinet. kotak pindah ini sudah disempurnakan dengan adanya aliran udara halus yang dihembuskan dari blower kira-kira 100 hembusan per menit, melalui suatu filter yang sangat halus sehingga mikrobia dapat tersaring olh adanya filter tersebut. Dengan demikian udara yang mengalir atau hembusan udara tersebut adalah udara steril yang dapat mencegah kontaminan yang berasal dari airborne selama kegiatan penanaman. Kotak pindah dengan aliran udara melalui suatu filter HEPA (High Efficiency Particulate Air) dengan pori-pori < 0.3 um.
Dulu, kotak pindah ini tertutup bidang mukanya selama masa pelaksanaan dengan pembukaan seminimum mungkin, hanya tempat memasukkan tangan, kotak pindah semacam ini disebut dengan entkas. Entkas ini dapat dibuat dari kaca semua atau kayu dan bagian mukanya saja yang terbuat dari kaca. Di dalam kotak ini terdapat lampu germisida yang memancarkan radiasi ultraviolet untuk mensterilkan permukaan tempat kerja dalam kotak pindah ini. Disamping lampu ultra violet, kotak ini dapat juga disterilkan dengan penyemprotan alkohol 70% atau formalin tablet atau larutan formalin.
Sebelum mulai bekerja, permukaan tempat kerja dari laminar air flow cabinet dilap dengan kapas yang telah dicelup dalam alcohol 70% atau dalam larutan kaporit atau dapat juga disemprot menggunakan spiritus (untuk menghemat biaya). Ada juga tipe laminar air flow cabinet yang dilengkapi dengan lampu ultra violet. Sebelum kerja, lampu ultra violet dinyalakan selama beberapa waktu antara ½-1 jam untuk mematikan kontaminan di permukaan tempat kerja. laminar air flow cabinet harus dijaga dibersihkan dengan alkohol dengan menyalakan lampu ultra violet sebelum mulai bekerja atau sesudah melakukan kegiatan selama ½-1jam.
Sterilisasi Alat-Alat dan Media
Alat sterilisasi baik media maupun peralatan yang digunakan untuk proses isolasi dan penanaman eksplan yang sering digunakan adalah autoklaf. Tipe autoklaf yang dapat digunakan untuk sterilisasi ada bermacam-macam, mulai dari yang sederhana sampai digital (terprogram). Autoklaf yang sederhana menggunakan sumber uap dari pemanasan air yang ditambahkan ke dalam autoklaf. Pemanasan air dapat menggunakan kompor atau api Bunsen. Dengan autoklaf sederhana ini, tekanan dan temperatur diatur dengan jumlah panas dari api.
Kelemahan autoklaf ini adalah bahwa perlu penjagaan dan pengaturan panas secara manual, selama masa sterilisasi dilakukan. Tetapi autoklaf ini mempunyai keuntungan: sederhana, harga relatif murah, tidak tergantung dari aliran listrik yang sering merupakan problema untuk negara-negara yang sedang berkembang, serta lebih cepat dari autoklaf listrik yang seukuran dan setaraf.
Autoklaf yang lebih komplit menggunakan sumber energi dari listrik. Alatnya dilengkapi dengan timer dan thermostat. Bila pengatur automatis ini berjalan dengan baik. Maka autoklaf dapat dijalankan sambil mengerjakan pekerjaan lain. Kelemahannya adalah bila salah satu pengatur tidak bekerja, maka pekerjaan persiapan media menjadi sia-sia dan kemungkinan menyebabkan kerusakkan total pada autoklaf. Sebagai sumber uap, juga berasal dari air yang ditambahkan ke dalam autoklaf dan didihkan.
Untuk laboratorium komersial, diperlukan autoklaf dengan kapasitas besar dan sumber uap biasanya dari boiler yang terpisah. Autoklaf ini sangat cepat dan dapat diprogam waktu sterilisasi, serta waktu pendinginan. Setelah sterilisasi bahan atau alat selesai, temperatur dan tekanan autoklaf diturunkan secara perlahan-lahan dalam waktu 15-20 menit. Pada autoklaf yang programmable, panas ini diatur secara atomatis. Tetapi pada autoklaf yang sederhana hal ini harus diatur secara manual.
ALAT DAN BAHAN
| Alat | Bahan |
| Vacum cleaner | Disenfectan |
| Kemoceng | Air aquades |
| Lap pel | Sabun cuci piring (sunlight) |
| Lap piring | Alcohol 70% |
| Timbangan analitik | Gula pasir 20 gram |
| Tissue | Agar-agar putih 7 gram |
| Tabung Erlenmeyer | ZPT (BA 10 ml dan NAA 1 ml) |
| Alumunium foil | |
| Pengukur pH/pH meter | |
PEMBAHASAN DAN CARA KERJA
Tahap kultur jaringan adalah sebagai berikut:
Tahap I
Persiapan alat, bahan , serta pembuatan media
1. Sterilisasi alat dan ruangan
Pembersihan alat-alat atau instrumen dan gelas dengan sabun cuci piring yang gosok dan di bilas dengan air mengalir atau air kran. Alat tersebut harus dibilas hingga bersih, alat harus dipastikan bersih dari kotoran dan sabun tidak masih menempel. Setelah alat dipastikan bersih dari kotoran dan sisa sabun cuci yang digunakan untuk mencuci, alat-alat tersebut kemudian di bungkus dengan kertas tebal kemudian di sterilkan dalam autoclave dengan temperatur 1210 C dengan tekanan 17.5 psi selama 1 jam (perhitungan waktu sterillisasi setelah tekanan yang dibutuhkan tercapai).setelah di sterilkan dalam autoclave, alat-alat disimpan dalam oven dan dikondisikan pada suhu 1600 C selama 2-3 jam. Sebagai catatan, setiap alat yang digunakan harus di ambil dari oven sehingga alat sudah dipastikan steril.
Jadwal kegiatan sterilisasi alat paraktikum di BPBHAT pasirbanteng
| Hari, tanggal | Uraian kegiatan | keterangan |
| Rabu, 21-04-2010 | Sterilisasi basah botol dan alat | Menggunakan autoclave |
| Sterilisasi kering botol dan alat | Menggunakan oven | |
| Sterilisasi kering dan basah pada botol dan alat | Menggunakan autoclave kemudian dilanjutkan dengan menggunakan oven | |
| Sterilisasi kering botol | Menggunakan oven |
Selain sterilisasi alat dilakukan juga sterilisasi ruangan. Kegiatan ini adalah salah satu penunjang keberhasilan dari proses kultur jaringan. Karena seperti yang kita ketahui bahwa kultur jaringan sangat membutuhkan keadaan yang sangat aseptic.
Jadwal kegiatan sterilisasi ruangan di BPBHAT Pasirbanteng
| Hari, tanggal | Unit kegiatan | Keterangan |
| Rabu , 21-04-2010 | Sterilisasi ruang | Proses sterilisasi total pada ruangan lab dan sekitar lab |
2. Sterilisasi bahan
Sterilisasi bahan media tanaman memiliki perbedaan dengan sterilisasi alat. Botol yang berisi media haruslah di tutup rapat dengan alumunium foil. Setelah di tutup, beri label dan disterilkan pada autoclave dengan temperatur 1210 C dengan tekanan 1.75 psi selama 30 menit (perhitungan waktu sterilisasi setelah tekanan yang dibutuhkan tercapai) sedangkan untuk botol yang berisi aquadesh ataupun alat-alat instrumen disterilkan selama 1 jam.
Jadwal kegiatan sterilisasi media praktikum di BP BHAT Pasirbanteng
| Hari, tanggal | Unit kegiatan | Keterangan |
| Rabu , 21-04-2010 | Sterilisasi media sub kultur | Dilakukan selama 30 menit di dalam autoclave, hal ini dilakukan agar media dalam keadaan steril saat akan di pakai |
3. Pembuatan media
Media tanam kultur adalah tempat tumbuh eksplan, maka kandungan di dalamnya harus mampu memenuhi semua kebutuhan pertumbuhan jaringan tanaman. Media tanam haruslah terdiri dari:
1. Unsur Hara Makro
Unsur hara makro adalah semua unsur hara yang diperlukan dalam jumlah banyak, jenis unsur hara makro antara lain:
· Nitrogen
· Hydrogen
· Oksigen
· Posfat
· Kalsium
· Magnesium
· Sulfur
2. Unsur Hara Mikro
Unsur hara mikro adalah unsur hara yang diperlukan dalam jumlah sedikit tetapi harus tetap tersedia agar proses metabolisme dapat terselesaikan. Unsur yang termasuk unsur hara mikro untuk tanaman adalah:
· Fe
· Me
· Zn
· B
· Co
· Cu
· Mo
3. Vitamin
Vitamin juga harus tersedia dalam media tanaman. Untuk memenuhinya dapat digunakan:
· Thiamine untuk menambah Vitamin B1
· Nicotinic acid untuk menambah Niacin
· Pyridoxin untuk menambah Vitamin B6
4. Gula
Gula merupakan sumber energi dan tekanan osmotic media karena gula merupakan karbohidrat. Gula yang dapat digunakan adalah sukrosa atau gula pasir.
5. Asam amino dan N Organik
6. Senyawa kompleks alamiah
7. Buffer, terutama buffer organik
8. ZPT (Zat Pengatur Tumbuh)
Zat Pengatur Tumbuh sangatlah diperlukan untuk merangsang tumbuhnya tunas dan akar. Untuk tanaman yang ingin di rangsang pertumbuhan akarnya maka auksin ditingkatkan, auksin yang dapat digunakan adalah NAA. Hormon untuk merangsang tumbuhnya tunas adalah sitokinin, sehingga apabila di inginkan tumbuhnya tunas maka nedia diperbanyak sitokininnya dalam bentuk BAP. Sehingga penggunaan konsentrasi ZPT tergantung pada tujuan kulturnya.
9. Bahan pemadat
Tujuannya adanya bahan pemadat dalam media tanam adalah agar kultur stabil. Zat yang dapat digunakan untuk pemadat adalah agar-agar.
Berikut adalah bahan yang dibutuhkan untuk membuat media kultur jaringan:
1. NH4NO3 22. KCl
2. KNO3 23. Na2SO4
3. H3BO3 24. Na2PO4H2O
4. KH2PO4 25. (NH4)2SO4
5. KI 26, Ferrie Tortrate
6. Na2M0O4 27. Ca3(PO4)2
7. CoCl2 28. NAH
8. CaCl22H2O 29. Bensil Adenin (BA)
9. MgSO47H2O 30. NaH2PO4
10. MnSO44H2O 31. Na2MoO42H2O
11. ZnSO45H2O 32. Auxilin
12. CuSO45H2O 33. Carbon
13. Na2Edta 34.Ca(NO3)24H2O
14. FeSO47H2O 35. MoO3
15. Thiamine HCl 36. Gelrite
16. Nicotinic acid 37. NaOH
17. Pyridoxine HCl 38. HCL
18. Glycine 39. KOH
19. Myo Inositol 40. Clorox
20. Cystein HCl 41. Casein Hidrolisate
21. Inositol 42. Sacarose/sukrose/C12H22O11
22. Fe2(SO4)2
STOK MEDIA MS (MURASHIGE and SKOG)
| STOK | KODE UNSUR | Mg/L | STOK/Gr/100Cc | PIPET Cc/l | PELARUT |
| A | NH4NO3 | 1650 | 8,25 | 20 | Aquades |
| B | KNO3 | 1900 | 9,50 | 20 | Aquades |
| C | H3BO3 | 6,2 | 0,124 | | NAOH |
| | KH2PO4 | 170 | 3,40 | | Aquades |
| | KI | 0,53 | 0,0166 | 5 | Aquades |
| | Na2MoO4 | 0,25 | 0,005 | | Aquades |
| | CoCl2 | 0,025 | 0,0005 | | Aquades |
| D | CaCl22H2O | 440 | 8,8 | 5 | HCl |
| E | MgSO47H2O | 370 | 7,4 | | Aquades |
| | MnSO44H2O | 22,3 | 0,446 | | Aquades |
| | ZnSO45H2O | 5,6 | 0,172 | 5 | Aquades |
| | CuSO45H2O | 0,025 | 0,0005 | | Aquades |
| F | Na2Edta | 37,3 | 0,746 | 5 | NaOH |
| | FeSO47H2O | 27,8 | 0,556 | | |
| G | Thiamine HCl | 0,1 | 0,002 | 10 | Aquades |
| | Nicotinic Acid | 0,5 | 0,01 | | |
| | Pyridoxine HCl | 0,5 | 0,1 | | |
| | Glycine | 2 | 0,04 | | |
| H | Myo Inositol | 100 | 2 | 5 | Aquades |
| | Cystein HCl | 2 | 0,04 | | HCL |
| | Casein Hidrolisate | 100 | 2 | | Aquades |
Ket : warna hitam tebal yang dibuat pada saat praktikum
KESIMPULAN
Teknik kultur jaringan metode untuk mengisolasi bagian tanaman serta menumbuhkan bagian-bagian tersebut dalam media buatan secara aseptic sehingga sterilisasi pada ruangan, alat dan bahan yang digunakan untuk media harus benar-benar steril, supaya tidak terjadi kontaminasi pada media tanam yang akan digunakan yang menyebabkan explan rusak seperti berjamur dsb, juga tidak dapat tumbuh sebagaimana yang diharapkan.
DAFTAR PUSTAKA
- Nogroho, H Sugito., Pedoman Pelaksanaan Teknik Kultur Jaringan, 1996
- http://elearning.unram.ac.id/KulJar/BAB%20I%20PENDAHULUAN/GAYA%20BELAJAR%20KULTUR%20JARINGA %20MELALUI%20PUBLIKASI%20WWW.h
- D.P.S. Hendaryono, A. Wijayani., Kultur Jaringan (Pengertian dan Petunjuk, 1994)
- Zulkarnain, Pengantar Teknik Kultur Jaringan Tanaman, 1997
Tidak ada komentar:
Posting Komentar